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        PCR實驗操作程序比朗儀器實驗設備(上海、成都、西安)有限公司

        技術服務信息

        服務名稱:PCR實驗操作程序
        服務類別:培訓服務 - 其它培訓
        價格:詢價
        允許參觀:允許參與實驗
        所在區域:四川.成都
        更新時間:2009/11/12 9:55:00
        瀏覽人數:5669
        誠信指數:114點
        了解更多:進入公司展臺
        使用范圍:僅限科研使用,不能應用于臨床
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        供應商聯系卡

        比朗儀器實驗設備(上海、成都、西安)有限公司
        地址:
        成都市人民南路四段27號商鼎國際2幢2單元802室
        郵編:
        610041
        電話:
        028-85235578,85235086
        傳真:
        028-85239418
        聯系人:
        田小姐
        所在區域:
        四川·成都
        郵件:
        公司展臺:

        技術服務詳細描述

        1. 在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣:

        反應物 加樣順序 體積(μl) 終濃度

        去離子水 1 29.4
        10×Buffer B 2 5 1×
        4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L
        MgCl2 4 3 1.5mmol/L
        有義引物 5 2.6 0.25μmol/L
        反義引物 6 2.6 0.25μmol/L
        模板 7 2 0.1μg
        TaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit

        2. 用微量可調加樣器和一次性Tip向每一管中加50μl礦物油。每加一管換一次Tip。
        3. 振蕩每只管,然后短暫離心。
        4. 將管放到預熱的熱循環中,按下列程序開始循環:
        預變性 94℃ 4分鐘 1次

        變性 94℃ 1分鐘
        退火 37-65℃ 1分鐘
        延伸 72℃ 1分鐘
        循環30次

        終延伸 72℃ 7分鐘 1次
        保存 4℃
        5. 將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,分析結果。電泳條件:60-80V,15-20分鐘。
        6. 紫外分析儀檢查電泳結果。

        四、討論

        1.假陰性,不出現擴增條帶
          PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量,④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
          模板:①模板中含有Taq酶抑制劑,②在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。③模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,有可能是模板核酸提取過程出了毛病,可使用陽性對照的DNA模板配合檢查模板質量。
          酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。
          引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:①選定一個好的引物合成單位。
        ②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。
        ③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏,導致引物變質降解失效。
        ④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

          Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
          反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul,應用多大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul
        后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。
          物理原因:變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率,退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下
        擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
        靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

        2.假陽性
          出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。
          引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增
        時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。
        靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:
        ①操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。
        ②除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。
        ③必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

        3.出現非特異性擴增帶
        PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有:
        ①必要時重新設計引物。
        ②減低酶量或調換另一來源的酶。
        ③降低引物量,適當增加模板量,減少循環次數。
        ④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

        4.出現片狀拖帶或涂抹帶
          PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量
        差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:
        ①減少酶量,或調換另一來源的酶。
        ②減少dNTP的濃度。
        ③適當降低Mg2+濃度。
        ④增加模板量,減少循環次數。

        生物在線聲明:以上所展示的信息由企業自行提供,內容的真實性、準確性和合法性由發布企業負責。生物在線對此不承擔任何保證責任。

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